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澳客彩票:如何利用GST标签蛋白纯化蛋白(上)

文字:[大][中][小] 手机页面二维码 2022-07-16 04:54:47    来源:澳客彩票官网 作者:澳客彩票官网注册 浏览次数:7    

  目前有多种用于蛋白纯化的亲和标签,而GST标签就是其中之一。GST是谷胱甘肽巯基转移酶的简称,指的是整个蛋白质,而不是像Rho1D4标签仅指几个氨基酸。自20世纪80年代末GST标签就开始用于蛋白质纯化(Smith & Johnson 1988),并被确立为需要极高纯度的蛋白质纯化试验的可靠方法(Harper & Speicher 2013)。GST标签的大小为26kDa,因此与其它蛋白质亲和标签相比确实很大。从理论上讲,它可以与蛋白质的C端或N端融合(Terpe 2003),但我们极力建议将其添加到N端。到目前为止,它已被成功地用于纯化细菌细胞(Smith和Johnson 1988)、酵母菌(Lu et al,1997)和哺乳动物细胞(Rudert et al, 1996)中的蛋白质。可以在本文其后查找其基础特征和序列。 所以我们现在知道,GST标签是一个完整的蛋白质去亲和吸附目标蛋白的标签,但谷胱甘肽巯基转移酶,确切的来说又是什么呢?

  GST是原核和真核生物酶家族之一,主要参与细胞和身体的解毒,最多可占一些哺乳动物细胞整个胞质蛋白质组的10%(Oakley 2011),催化的还原型谷胱甘肽的氧化反应,又称GSH。GST在细胞中的主要功能是保护DNA,使细胞内的蛋白免受外部有毒物质的影响。其机制是通过催化对有毒物质的亲核攻击,激活GSH的一个硫醇基团,与有毒物质上的合适基团反应,这种GSH与毒素的偶联会导致它们从细胞中排出或进一步代谢(Hayes et al,2004),并利用GST对还原型谷胱甘肽(GSH)的高特异性在纯化试验中得到高纯度蛋白。

  如上所述:有无数的GST正构体,但却选择了一个特定的正构体作为GST标签的模板。那么,为什么选择来自日本血吸虫的GST呢?

  谷胱甘肽巯基转移酶可以在从原核到真核的生物体中找到(Allocati et al,2008)。那么,为什么这种特定的GST蛋白可以被用于亲和纯化?其优点是什么?答案可以追溯到第一次描述GST作为亲和层析和蛋白质纯化的选择。如第一次引用提到GST用于蛋白质纯化是在1988年由Smith & Johnson发表的。而在此之前,Smith等人发表了一篇文章,讲述了GST可能被用于抗日本血吸虫的疫苗。

  日本血吸虫是一种疟原虫,是血吸虫病的主要病因,所以该血吸虫的GST蛋白有希望成为日本血吸虫的疫苗基础(Smith et al,1988)。因为这项研究,Smith已经研究了GST蛋白的这种特异性同源序列,因此它顺应成为了后文所阐述的蛋白纯化方法的基础。自1988年,日本血吸虫的GST一直被用作GST亲和标签使用的GST同工酶。

  我们汇编了有关GST标签及其蛋白纯化能力的重要数据。注:我们列出了用于pGEX载体的 标准 序列。

  是否可与其它亲和标签结合使用? 是的,请见我们的GST-and-Rho-tagged eGFP案例

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